精子表观基因组异常与男性不育（DNA甲基化+组蛋白修饰+ncRNA）｜新研究方向

尽管目前发现精子参数异常时即可诊断为男性不育，但精子参数对自然受孕和医学辅助生殖结果的预测能力较差，因此需要改进男性不育的诊断技术。越来越多的证据表明了精子表观基因组在胚胎发育早期调控中所起的作用，以至于研究人员将重点放在研究精子表观基因组的表观遗传机制上，以寻找男性不育的新分子标记。事实上，精子表观基因组异常可以解释一些精子参数正常但原因不明的男性不育，主要与体外受精（IVF）周期中胚胎发育不良有关。本文从基因表达调控的表观遗传机制（即DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA活性），讨论了环境因素可能导致人类种系表观遗传变化并影响胚胎发育以及子代表型的可能机制。综述了男性不育症患者精子表观基因组异常的研究，尤其是重度生精功能障碍患者。观察结果表明，精子表观基因组评估的诊断和预后结果将有助于促进男性不育的管理。

图形摘要：环境响应性精子表观基因组特征作为男性因素不育的诊断工具

精子表观基因组（The sperm epigenome）

传统意义上，人类表型被认为是基因型编码发育程序的结果。然而最近的研究表明，环境影响可以通过促进不影响潜在基因序列的基因组修饰来驱动主要的表型变化。这种通过基因表达和表型变化对细胞分化过程中响应周围环境的能力被称为“表观遗传发育可塑性”，这种可塑性可能有利于生存，但由于环境污染导致的种系表观遗传模式变化可能会促进疾病的表观遗传学跨代遗传，定义为在导致表型变异的持续直接环境影响缺失情况下，代际表观遗传信息的种系介导遗传。当种系在胎儿性腺性别确定过程中暴露时，种系中的表观基因组可以被修饰：这些表观突变可能逃脱受精后甲基化擦除，从而传递给子代。通过表观遗传修饰，如DNA甲基化、精子染色质修饰和非编码RNA（ncRNA）活性，可以独立于DNA序列调控基因组活性。

DNA甲基化由一系列DNA甲基转移酶家族催化，该家族将甲基从S-腺苷酸甲硫氨酸转移到胞嘧啶残基的第5个碳上，形成5m：甲基从DNA中突出干扰转录因子结合，从而抑制转录活性和基因沉默。DNA甲基化与启动子调控相关，其中约50%与CpG二核苷酸簇（CpG岛）和重复DNA序列重叠。DNA甲基化通常稳定，但在发生发育关键时期，该过程更具动态性。可以发生在胚胎发生的早期阶段、受精后和配子体发生期间。这种表观遗传重编程旨在去除亲本成年期间积累的大多数表观遗传变化，以最大程度地减少其对子代的潜在有害影响，并且对于在发育过程中获得多能干细胞状态至关重要。尽管在原始生殖细胞（PGC）中整体去甲基化导致CpG岛上几乎所有DNA甲基化急剧丢失，但CpG甲基化丢失与人类种系中基因表达变化无关。此外特定基因组区域（PGC中的亚端粒和反转录转座子区域，胚胎细胞中的印迹位点以及较低密度的CpG区域）抵抗去甲基化擦除。人类精子中约70%的DNA处于甲基化状态，这种广泛的DNA甲基化对于精子发生进展和子代活力至关重要。

在精子发生过程中，精子染色质经历广泛重塑，体细胞组蛋白被睾丸特异性组蛋白变体取代，这改变了核小体稳定性，增加了DNA对结合因子的可及性，促进核小体向过渡蛋白的转换，然后向精蛋白转变，并允许将父系基因组包装成高度浓缩的精子核，从而使父本基因组转录失活。一些组蛋白变体存在于早期减数分裂精母细胞通过晚期伸长的精子细胞中，而一些仅存在于单倍体精子细胞中。组蛋白受到动态翻译后修饰的影响，对精子发生过程中基因表达调控至关重要，可以作为表观遗传标记，传递给子代。当人类精子中组蛋白向精蛋白（histone-to-protamine）的转变完成时，约10-15%基因组仍然包裹在组蛋白周围，且并非随机定位，而是保留在参与精子发生和胚胎发育的重要调控基因上。精子保留的组蛋白景观的破坏与子代的严重发育缺陷有关。

精子中含有ncRNA分子作为表观遗传因子，将精子ncRNA注射到小鼠受精卵中会介导子代的表观遗传表型变异。ncRNA为正常胚胎发育所必需。精子RNA谱十分复杂，包括长链非编码RNA（lncRNA）和短链非编码RNA（sncRNA），sncRNA包括microRNA（miRNA）、piwi互作RNA（piRNA）、tRNA衍生小RNA（tsRNA）和rRNA衍生小RNA（rsRNA）。其功能不是编码蛋白质，而是表观遗传调控基因表达。精子lncRNA功能知之甚少，但已提出它们通过在早期胚胎发育中引起表观遗传修饰来调控基因表达。sncRNA货物（cargo）数量和组成在精子发生过程中有所不同，不同的miRNA簇在通过附睾在PGC、精原细胞、精母细胞、精子细胞和成熟精子中表达。miRNA通过抑制或激活翻译或通过靶向mRNA降解来调控基因表达。它们与精子发生的调节有关，且改变的miRNA表达会导致精子异常、生精停滞和男性不育。此外，miRNA可能在胚胎发育早期的早期组蛋白替代、基因表达和表观遗传修饰调控中发挥作用。piRNA在生殖细胞中高表达，但在成熟为成熟精子之前丢失。在精子发生过程中，它们在转座子沉默和基因组稳定性中的作用已达成广泛共识。tsRNA的作用机制知之甚少，但与获得性代谢紊乱的代际遗传和通过调节胚胎基因组激活调控早期胚胎分裂相关。此外，tsRNA已被证明参与表观遗传学跨代遗传。

RNA修饰也被证明在精子发生的表观遗传编程中起作用。最常见的RNA修饰是N6-甲基腺苷（m6A），这种一种由RNA甲基转移酶复合物Mettl3、Mettl14和Wilms肿瘤1相关蛋白催化的可逆修饰。可以由去甲基化酶、脂肪质量和肥胖相关蛋白消除，并参与mRNA剪接、翻译效率和microRNA加工。在成体睾丸发育过程中，RNA m6A调控因子几乎在所有类型的睾丸细胞中表达。在Mettl3基因敲除小鼠中的实验表明，Mettl3调控精原细胞分化和减数分裂，对男性生育和精子发生至关重要。在不育男性中也发现了失调的RNA m6A调节因子和由此产生的RNA m6A失衡，然而目前尚不清楚RNA m6A失调如何导致生精功能障碍。

特发性男性不育：表观遗传学跨代遗传的作用

在过去的50年里，人类精子总数急剧下降（未经选择的男性总体下降62.3%）、男性不育增加和一系列男性生殖问题趋势相对应，包括睾丸癌、性发育障碍、隐睾症、尿道下裂、睾丸激素水平低和精液质量低等，表明环境暴露在生精功能障碍和男性不育发病机制中的可能作用。事实上，环境暴露与雄性不育之间的联系已经在大鼠研究中得到了实验证明。大鼠作为一种很有用的动物模型，性成熟较早、妊娠期较短，可以在相对较短的时间内进行跨代分析。F0代妊娠雌性大鼠实验性暴露于杀菌剂vinclozolin或农药二氯二苯基三氯乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane）中，可促进45%未暴露F3代雄性群体睾丸病理学的表观遗传跨代遗传（生精小管萎缩、生精上皮空泡、小管腔生精细胞脱落），而对照群体中这一比例为8%，由其他毒物诱导的其他研究中观察到结果相似。祖辈暴露通过Sertoli细胞表观基因组和转录组的分子改变促进了睾丸疾病易感性的表观遗传跨代遗传。

尽管无法在人类受试者中复制相同的研究设计，但已证明环境因素可能会诱导人类生殖细胞表观基因组的异常表观遗传变化，并影响后代的表型。Hamad及其同事评估了香烟烟雾对一组精心挑选的不育男性精子表观基因组的影响，这些男性精子数量正常（>2000万/ml），并且没有已知的混杂因素（睾丸手术或病理史，急性或慢性尿路感染和慢性疾病）。根据吸烟习惯（19名不吸烟者和35名重度吸烟者）将两组分为两组，发现重度吸烟者的组蛋白向精蛋白的转变异常。Wu等人（2017）发现尿邻苯二甲酸酯与131个精子差异DNA甲基化区域（DMR）有关。许多DMR与代谢物有关，其母体化合物具有已知的抗雄激素作用，并在与生长发育相关基因中富集。Greeson等人（2020）证明，暴露于多溴联苯化合物的混合物会导致精子表观基因组改变。Shnorhavorian等人（2017年）发现，19至30岁的骨肉瘤男性幸存者在14-20岁时接受了基于顺铂的化疗方案 岁时，所有染色体上都存在精子表观突变，在CpG deserts中有许多统计学上过度代表的DMR簇（表位突变特征），而在CpG岛中没有发现，这种基因组特征与之前在其他物种中使用各种不同的暴露鉴定出的相似。

不育男性的表观遗传异常

最近的一项系统综述表明，评估男性不育与精子表观突变之间相关性的研究提供了相互矛盾的结果，主要是由于研究设计的差异、分析DNA甲基化的不同方法、研究的不同人群以及用于分析DNA甲基化数据的统计模型的广泛差异。此外，虽然早期研究表明不育男性印迹基因异常甲基化，但这一结果并未得到进一步研究的证实。精心设计的研究已经阐明了原因：印迹基因不受调控且稳定，不受环境因素的影响，因此与环境诱导的表观遗传跨代遗传无关。印迹位点是关键的表观遗传和基因遗传位点，但与大多数细胞分化过程中环境响应或改变的表观遗传位点不同。尽管印迹基因表达可能会改变，但印迹位点的差异甲基化尚未显示出改变。

正如系统综述（Asenius等，2020）的作者所指出的那样，在基因组规模的无偏倚分析中，没有令人信服地复制男性不育的特定特征，并不意味着精子表观基因组分析在不育男性中毫无价值。

DNA甲基化（高甲基化）的增加可能是早期配子发生和/或精子发生过程中发生的男性不育分子疾病病因学的一个方面。睾丸生殖细胞中的基因启动子通常低甲基化；因此启动子高甲基化可能导致精子发生中关键基因沉默，从而影响精子产生和患者的生育力。对重度生精功能障碍（非阻塞性无精子症：NOA）的研究一致表明，与精子发生未受损的阻塞性无精子症（OA）患者相比，NOA患者的睾丸DNA甲基化模式显著不同。Ferfouri等人（2013）对96例无精症患者、29例OA患者和67例NOA患者的睾丸样本进行分析，分析结果表明，27578个筛选的CpG位点中超过9000个的甲基化谱在两组之间存在显著差异。此外，在NOA患者中，与粗线期成熟停滞（存在精原细胞和精母细胞）的患者相比，仅支持细胞综合征（SCO：生殖细胞发育不全）的患者在甲基化谱方面存在显著差异。Wu等人（2020）发现NOA和OA患者之间存在明显不同的表观遗传模式，其中包括与代谢通路和激素应答相关的表观遗传修饰基因本体论（GO）。Li等人（2017）研究了严重少精症男性与OA男性的睾丸组织，发现960个CpG位点与1440个不同基因相关，其中包括几个在男性不育中具有已知功能的基因，DNA甲基化存在显著差异。最后Di Persio等人（2021年）分析了与OA患者相比患有隐精症的男性，对同一组样本之间的甲基化值进行范围筛选，以鉴定271个与132个基因相关的DMR，其中61个在精子发生过程中受到调控，并在多个阶段相关。值得注意的是，已经证明表观遗传特征仅在干细胞分化的早期阶段（从PGC到精原细胞）发生显著变化，而种系发育的后期阶段在表观遗传性状方面显示发育阶段之间的变异性较小。这意味着具有不同组织病理学模式的患者（即与低精子发生患者相比具有成熟停滞或混合萎缩的患者）的不同睾丸细胞组成不会影响表观遗传学分析。

除了精子甲基化模式外，与精子发生完整的男性相比，NOA患者的ncRNA表达似乎也有所变化。一项对20例OA患者和60例NOA患者进行显微切割睾丸精子的研究，通过RNA深度测序，表明了两组患者的miRNA谱差异显著。一些差异表达的miRNA靶向参与精原细胞分裂和分化的基因（成纤维细胞生长因子受体3、SMAD家族成员3、Sp1转录因子、V-Akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物3（AKT3））或参与调控减数分裂的基因（转化生长因子β受体1）。

精子表观基因组作为男性不育症的诊断工具

由于精子参数不能预测自然受孕或医学辅助生殖的结果，并且鉴于精子表观基因组在调控早期胚胎发育中所起的关键作用，精子表观遗传学分析已被提出作为改善男性不育临床诊断的替代策略。迄今为止，旨在解决这个问题的研究取得了令人鼓舞的结果。

尽管精子参数正常，但不明原因不育男性仍无法怀孕。Urdinguio等人（2015年）分析了17名具有生育力的男性和29名特发性不育男性，两者均表现出正常的精子参数，发现与具有生育力的受试者相比，近3000个CpG在不育患者中显示出异常的甲基化。这些异常变化与精子特异性甲基化区域和特定组蛋白标记如H3K4me3有关。Salas-Huetos等人（2016）发现，精子参数正常且无女性不孕因素的不育男性与有生育能力的男性相比，具有明显的miRNA载体。与可育男性相比，共发现57种miRNA在不育男性中差异表达，且参与基本生物学过程的基因表达失调，包括胚胎发生（即胚胎形态发生和染色质修饰）。这些结果表明，精子表观基因组变化可能解释了一些原因不明的男性不育症。

研究表明，精子表观基因组也可以预测自然受孕。一项分析96名精子参数正常且特发性不育男性的研究鉴定出了反映生殖状态的精子RNA元件（SREs）。这些SRE的缺失大大降低了通过定时性交或人工授精（IUI）实现活产的可能性。共有30%的特发性不孕症男性表现出不完整的SRE，而当所有必需的SRE都存在时，女性因素被确定。精子的表观遗传时钟（一种先前用于其他临床领域的指标）分析被认为是衰老的生物标志物，同时显示出对癌症、心血管疾病和全因死亡率的良好预测能力。一项由379对夫妇组成的前瞻性妊娠队列（LIFE研究）显示，精子表观遗传衰老（SEA）与妊娠时间（TTP）呈负相关，SEA每增加1年，TTP就会延长17%。

最近一项对大量不育男性样本（1344例不育患者，43例可育精子捐献者）的研究表明，参与肽酶调控的启动子甲基化变化导致IUI周期妊娠率降低；由于这些男性中有77.8%表现出正常的精子参数，因此这种表观遗传特征可以鉴定出精液分析无法识别的低生育潜力男性。

精子表观基因组分析也可以预测IVF结果。Denomme及其同事对40名接受供体卵母细胞IVF周期的正常精子不育男性进行了分析，根据囊胚质量分为大小相同的两组。优质胚胎组中男性至少有20%胚胎具有D5级“AA”胚泡，60%胚胎具有可移植质量（等级≥'3BB'），而劣质胚胎组中有10%的胚胎具有D5级“AA”胚泡，40%胚胎具有可移植质量。精子甲基化阵列芯片数据显示，在保留组蛋白的1634个CpG探针位点在两组上存在统计学差异，“优质组”的患者表现出主要的高甲基化特征，而“劣质组”的男性表现出统计学上显著偏离预期的甲基化水平。GO分析揭示了参与精子-卵母细胞融合、胚胎基因组激活、植入潜力和胚胎分化调控的基因富集。此外，“劣质组”精子甲基化变化与父系miRNA谱改变相关，而参与与胚胎基因组激活、胚泡植入和DNA甲基化相关的靶基因也发生相应变化。Hua等人评估了87例接受IVF的正常精子症患者，根据优质胚胎比率分为两组（高胚胎率≥75%，N=23和低胚胎率≤25%，N=64）。两组的母系年龄和成熟卵母细胞数量一致。在两组之间发现了10个差异表达的tsRNA、7个差异表达的rsRNA和5个差异表达的miRNA，基于tsRNA、rsRNA和miRNA的主成分分析可以对两组（高质量组和低质量组）的精液样本进行分类，具有良好的预后能力（AUC=tsRNA、rsRNA和miRNA分别为0.8716、0.85和0.7）。Aston及其同事评估了127名接受IVF的男性，根据胚胎发生良好且阳性妊娠（N=55）或胚胎发生不良（N=72）（成功妊娠N=42、未成功妊娠N=30）分为两组，54名已证实生育能力的正常精子男性作为对照组。精子DNA甲基化模式在不同个体的样本中非常稳定：当比较可育患者和接受IVF的患者时，发现>8500个CpG具有显著的甲基化差异。使用差异甲基化CpGs建立的预测模型能够鉴定出灵敏度为82%的IVF患者，AUC为0.93，构建用于识别胚胎质量良好与较差患者的模型能够将46%的患者分类为胚胎质量较差组，具有高特异性和阳性预测值，AUC为0.73。另一方面，精液参数和男性或女性年龄都不能预测胚胎质量和IVF结果。最后，一项评估复发性流产夫妇的47名男性伴侣和39名已证实生育能力的男性的研究发现，各组之间有9497个差异甲基化CpGs，功能注释显示117个差异甲基化基因参与胚胎发育，13个参与胎盘发育。

睾丸组织和精浆中的ncRNA表达已被预测为NOA男性残留精子发生的候选生物标志物，以预测这些患者手术前成功取精的机会。事实上，已经发现特定miRNA簇表达变化与严重的生精功能障碍相关。研究发现，编码五种miRNA（miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b和miR-449c）的两个功能相关miRNA簇（miR-34b/c和miR-449）同时失活会导致减数分裂进程缺陷和严重的生殖细胞耗竭。一项关于正常精子发生（NS）男性和由于成熟停滞（MA）或SCO导致NOA男性睾丸miRNA表达的研究证实了这些结果。在三组中发现了不同的miRNA表达谱，其中miR-34b/c和miR-449表达在SCO组中显示出最大的倍数变化减少，而MA组与NS组相比，miR-34b和miR-449a表达也显著降低。与精子提取成功的患者相比，精子提取失败的SCO患者和NOA患者的精浆中miR-34c-5p的表达显著降低，这为其在临床上用于诊断和预后目的奠定了基础。

最后，分析精子表观基因组可能有助于确定潜在的治疗应答者，类似于其他医学领域的尝试。解决男性因素不育的一个有前途的医学策略是使用卵泡刺激素（FSH）治疗来改善不育男性的精液参数和生殖能力；然而，并非所有患者都对治疗应答。为了鉴定特发性男性不育症患者对FSH治疗可能应答的表观遗传特征，研究人员利用精子少精症男性同质队列和可生育供体对照组精液样本中精子DNA甲基化的全基因组变化进行分子分析，不育组接受FSH治疗，而对照组未接受任何治疗。在治疗3个月后，如果精子参数增加了两到三倍，可以确定为对治疗应答。从不育和可育受试者的比较中，鉴定出217个DMR，P<1e-05，有效的分离了不育患者群体和非不育患者群体，重叠最小。在一些由于排除(主要是因为吸烟和饮酒习惯)而未用于最初试验的有生育能力和不孕症患者中进行了验证试验，从而获得了确认。在所有不育患者的精子样本中均揭示了DMR的不育特征，显示了分子生物标志物的有效性。与不应答者相比，FSH治疗的应答者表现出差异的表观遗传生物标志物（56个DMR，P<1e-05），高甲基化和低甲基化变化分布一致。与高甲基化普遍存在的不孕症诊断相反，不孕症DMR和FSH应答者DMR之间没有观察到重叠，表明一组特异性表观遗传变化。这些结果如果得到进一步研究的证实，将有助于开发治疗性表观遗传生物标志物。

结论

越来越多的证据表明精子表观基因组异常与男性不育之间存在关联。正如本文所讨论的，表观遗传特征可以潜在地用于提高对不育男性的诊断和管理，并建立模型来预测自然受孕或体外受精（IVF）结果的个体概率。然而，目前还没有足够的证据来得出精子表观基因组评估对不育男性的诊断特性的最终结论。进一步的研究应明确精子表观基因组异常与男性不育之间的确切因果关系，并确定特定的表观遗传特征，以改善目前的治疗方案。在设计进一步的研究时，需要考虑几个关键方面：所研究队列在年龄、种族和暴露于已知环境污染物方面应该是同质的；精子样本需要经过超声处理以破坏受污染的体细胞；应该考虑全基因组方法，而不是着眼于特定的遗传性状，因为表观遗传调控不仅是一个位点特异性事件，而且跨越由连续的CpG岛簇组成的染色体区域的长延伸；所使用的方法和生物信息学应该允许研究表观基因组的低密度CpG区域，这些区域占基因组的90%以上。必须采取这种办法来解决迄今为止所报告的相互矛盾的结果。

参考文献：CaroppoE, Skinner MK. Could the sperm epigenome become a diagnostic tool forevaluation of the infertile man? Hum Reprod. 2023 Dec 26. pii: 7499707. doi:10.1093/humrep/dead266. PubMed PMID: 38148019.