最新7+生信，从单细胞出发，结合肿瘤分型并建模，确定基因进行实验验证

生信小课堂

影响因子：7.3

研究概述：作为最致命的乳腺癌亚型，三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性极强的内分泌恶性肿瘤，复发率和远处转移率都很高。尽管化疗和新辅助免疫疗法在改善患者预后方面取得了进展，但许多患者仍会产生化疗耐药性。TNBC患者出现化疗耐药的可能性各不相同。一种推测认为，它与肿瘤微环境（TME）密切相关。与其他亚型相比，TNBC具有独特的TME，为癌细胞与周围的内皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞相互作用创造了有利的环境，可刺激病情进展。作为T细胞的一个特殊亚群，T调节细胞（Tregs）可抑制抗肿瘤免疫反应，并通过抑制T细胞增殖和细胞因子的产生来防止自身免疫。TME浸润的Tregs可通过激活免疫抑制和促肿瘤生成信号来创造免疫抑制环境，从而减少对化疗和放疗反应的影响。Tregs在TME中的潜在作用和Treg细胞的潜在治疗靶点可能为TNBC的肿瘤免疫疗法提供新的干预措施。本研究利用WGCNA确定了METABRICTNBC样本中与Treg浸润相关的模块。随后，根据与Treg浸润相关的模块建立了预后模型。随后证明Treg浸润相关基因模块可用于建立TNBC进展的临床相关分类。本研究揭示了TK1作为肿瘤生物标记物和免疫治疗靶点的潜力。研究流程如下：

研究结果：

正常乳腺上皮细胞和TNBC组织的scRNA-seq分析

从GSE125449中提取并重新分析了21个样本的scRNA-seq数据。在这些样本中，13个来自正常乳腺组织，8个来自TNBC，基于细胞marker定义了六个细胞群（图A）。为探索NKT细胞的异质性，作者将NKT细胞进一步分为5群（图B）。由于Treg细胞有利于肿瘤抑制性微环境的形成，而肿瘤抑制性微环境会促进肿瘤进展并降低对免疫疗法的反应，因此作者探讨了肿瘤形成过程中Treg细胞浸润的变化，发现与正常乳腺组织相比，Tregs在TNBC组织中的浸润明显增加（图C、D）。

根据Treg浸润对TNBC肿瘤进行分层

为了确定与Tregs浸润相关的关键标记基因，作者使用CIBERSORT算法对Treg浸润进行量化，并使用WGCNA检测与Treg浸润相关的基因模块。在METABRIC队列中发现了10个基因模块，其中蓝色基因模块与Treg浸润呈正相关，与患者生存状态呈负相关（图A）。利用METABRIC队列中的生存数据和蓝色模块基因的表达值，作者使用单因素cox回归使进行了生存分析，并确定了22个与Treg浸润相关的预后基因，然后根据这22个基因的表达值对METABRIC队列中的患者进行了无监督聚类（图B）与主成分分析（图C）。图D热图显示，这22个基因的表达模式在群组1和群组2之间存在差异。关联临床信息，与群组1相比，群组2患者的肿瘤分级、分期更高，生存状况更差（图E）。生存分析也显示，Cluster2组的预后比Cluster1组差（图F）。考虑到TNBC患者可能对多种化疗药物产生耐药性，作者使用oncopredict包评估了这两个群组对四种TNBC化疗药物的反应，发现群组1中的患者对这四种常见化疗药物更敏感（图G）。

Treg浸润相关预后模型的构建与验证

为了促进Treg浸润相关基因在预后中的临床应用，作者采用了LASSO和RF两种机器学习算法从所有22个Treg浸润相关基因中分别筛选出17和13个关键基因，其中有7个交叉基因（图A），多因素Cox回归模型证明了其独立危险性（图B）。随后作者构建了风险评分，将METABRIC队列中的患者分为两组，Treg浸润相关风险评分较高的患者OS较差（图C），时间ROC曲线也展示了其良好的预测性能（图F），这些结果在两个外部队列（GSE58812和SCAN-B）中得到了验证（图D,E,G,H）。

高风险和低风险评分组免疫相关特征的差异

为了揭示各风险评分组在通路激活方面的差异，作者计算了基于KEGG通路基因集的GSVA评分。图A表明高风险评分患者的代谢相关通路，而高风险评分患者的免疫相关通路的活化程度较低。此外，METABRIC队列和SCAN-B的CIBERSORT算法结果显示，与低风险评分患者相比，高风险评分患者的B细胞和CD8T细胞浸润较低，但Treg细胞和M2-巨噬细胞浸润较高（图B）。有趣的是，高风险组的肿瘤突变负荷（TMB）水平低于低风险组（图C）。此外，作者还发现了免疫检查点表达在低风险组和高风险组之间的差异，显示高风险组患者的免疫检查点基因表达低于低风险组（图D）。最后，作者计算了风险评分基因与免疫细胞浸润之间的相关性，结果表明大多数基因与促进免疫治疗反应的免疫细胞浸润（B细胞、CD8T细胞）呈负相关，而与Treg细胞浸润呈正相关（图E）。

评估药物和免疫疗法反应

作者收集了一个包含TNBC患者免疫治疗数据的数据集GSE173839。兔兔A表明免疫治疗无反应者的风险评分高于免疫治疗有反应者，图B表明高风险评分组免疫治疗失败的患者比例高于低风险评分组。此外，ROC曲线分析表明，Treg浸润相关风险评分在预测免疫治疗反应性方面表现出色（图C）。作者采用了使用CTRP和PRISM衍生的药物反应数据来确定在Treg浸润相关风险评分较高的患者中药物敏感性较高的候选药物。首先，在高Treg浸润相关风险评分组和低Treg浸润相关风险评分组之间进行差异药物反应分析，以确定在高Treg浸润相关风险评分组中估计AUC值较低的化合物（log2FC>0.10）。接下来，作者利用AUC值与Treg浸润相关风险评分之间的斯皮尔曼相关系数，筛选出相关系数为负的化合物。这些分析得出了10种CTRP衍生化合物（包括SGX-523、DNMDP、tivozanib、AZD6482、BRD-K04800985、PLX-4720、MK-0752、MI-1、BRD-K33199242和TG-100-115）（图Da）和4种PRISM衍生化合物（包括uprosertib、NVP-BEZ235、BAY-87-2243和temsirolimus）（图Ea）。所有这些化合物在高Treg浸润相关风险评分组的估计AUC值都较低，并且与Treg浸润相关风险评分成反比（图Db、Eb）。

诺曼图建立和评估

为了提高上述风险评分的预测能力，将风险评分和肿瘤大小结合起来，利用多因素cox回归分析建立了一个诺曼模型（图A）。1年、2年、3年和5年的疾病特异性生存（DSS）校正曲线显示，预测的生存概率与实际生存率一致，证明了该提名图在预测生存方面的稳健性（图A）。此外，作者还进行了DCA分析，结果显示诺曼图的预后价值优于单个变量的预后价值（图A）。在训练集和测试组中，诺曼图预测的AUC均超过了风险评分（图B-E）。

TK1是TNBC的关键风险评分因子和肿瘤促进因子

空间转录组分析结果显示，TK1阳性表达的细胞主要定位于肿瘤细胞。此外，在TK1高表达的TNBC组织中，Treg细胞的浸润也有所升高（图A、B）。为了检测TK1表达与Tregs之间的关系，作者采用Treg标记物FOXP3多重荧光染色法对31例TNBC患者进行了评估。不出所料，TK1的表达与Treg标记物FOXP3的表达状态呈正相关（图C-E）。这一结果表明，TK1表达较高的患者表现出更多的Treg浸润。

随后作者分析了TCGA泛癌症队列中TK1与Hallmark通路之间的关系。在多种癌症类型中，TK1与细胞周期和增殖相关通路（如MYC靶点和MTORCI信号通路）呈正相关（图A）。同时作者分析了TCGA队列中20种癌症类型的肿瘤和正常组织中TK1的表达情况；70%的肿瘤中TK1上调，包括BLCA、UCEC、HNSC、PRAD、KIRP、COAD、LUSC、KIRC、LIHC、BRCA、THCA、LUAD、CHOL、ESCA和STAD（图B）。生存分析表明，TK1的高表达与10多种癌症较差的预后相关（图C）。

为了验证TK1在TNBC中作为风险评分的关键角色以及肿瘤启动子的作用，作者进行了几项功能实验来检测对照组和siRNA介导敲除组的迁移、侵袭和增殖能力。HPA数据库显示，TK1在癌症组织中高表达（图A）。为了探索TK1在体外TNBC增殖和迁移中的作用，研究人员采用瞬时转染靶向TK1的方法抑制其表达（si-TK1-1和si-TK1-2）。TK1敲除后，TNBC细胞的迁移、侵袭和增殖能力下降，差异有统计学意义。与对照组相比，CCK-8（图D）和集落形成实验（图E）结果显示，沉默TK1分别显著降低了TNBC细胞的活力和增殖能力。此外，伤口愈合试验和Transwell试验的结果也显示，与对照组相比，TK1敲除后细胞的迁移能力下降（图C、F）。总之，这些发现共同证实了TK1能促进TNBC细胞的增殖和迁移。

研究总结：

在这项研究中，作者证明了TNBC中的Treg浸润相关基因可用于建立与临床相关的TNBC分类。基于三个TNBC队列，开发并验证了与Treg浸润相关的预后模型，确定了Treg浸润相关基因在肿瘤免疫微环境的发展和免疫治疗反应中的作用。此外，作者还发现与Treg浸润相关的风险评分呈负相关且药物敏感性较高的候选药物，它们可以预测TNBC的临床结果和免疫治疗反应。最终，作者通过表型实验验证Tregs可能通过调节TME内TK1的表达来影响肿瘤的发生、发展和预后。最终得出结论：Treg浸润相关预后模型可以拓宽我们对TNBC生物学和预后预测的理解，靶向Tregs是治疗TNBC的一种很有前景的方法。