细胞复苏培养方法与要点

细胞冻存与复苏的基本原则是慢冻快融，复苏一定越快越好，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞复苏培养与注意要点

1. 开启37 ℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80 ℃冰箱，让冻存管中的液氮挥发。

注意事项：这里提到需要将从液氮中的细胞先放在-80 ℃冰箱，主要是为了避免解冻时冻存管中的气温急剧上升，温差过大导致的爆炸。

2. 在生物安全柜中准备好所需的离心管，培养器皿，往15 mL离心管中加入5 mL以上的预热培养基。

预热是为了让刚复苏的细胞及时接触正常的生长环境。那为什么要加入5 mL以上的培养基呢？有3个原因：

（1）得到更多的细胞

（2）为了去除DMSO

（3）恢复渗透压。

海星的一步冻存液里面添加了多种组分，使得冻存液比较粘稠，它能让细胞在冻存的时候均匀的分布，不会轻易沉降，而我们想要得到更多的细胞，则需要将冻存液稀释。细胞在粘附性降低的情况下离心，能得到更多得细胞。

DMSO在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，研究结果表明，培养液中DMSO浓度为10 %时，细胞生长抑制率近100 %；1 %浓度时抑制率为35 %，即使是0.04 %的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。正是因为如此，细胞复苏后需要离心去除DMSO。

另外，正常培养时细胞有一个渗透压，而冻存时细胞处于高渗状态，添加培养基稀释是为了让细胞更快恢复至正常渗透压。

3. 从-80 ℃冰箱中取出细胞，快速将冻存管置于37 ℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化

注意事项：在这里需要注意，融化过程中需要晃动冻存管，保证冻存液融化均匀，一是防止长时间常温下DMSO对细胞产生毒性；二是在低温到常温的过程中，水分会重新进入细胞并形成冰晶，快速升温可以使冰晶迅速融化，避免伤害细胞。因此，必须在1-2分钟内使冻存液完全融化。

晃动时，也要注意水浴锅中的水不要没过冻存管管盖，避免增加污染风险，最好水浴锅中的水是无菌的。也可以将冻存管放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。出于卫生考虑，有些细胞房没有水浴锅，所以很多复苏操作，需要在不同实验室进行。如果两个实验室距离较远，且实验室室温较高，可提前准备一只干净的烧杯，装入37 ℃的水作中间缓冲。

另外一个关键点，管内冻存管融化至只剩约2毫米直径的冰晶时，即可停止水浴，继续晃动至冰晶融化。此时复苏的时间刚好，避免复苏过头。在这时，细胞还是皱缩的形态，处于高渗状态，需要立即转入生物安全柜进行稀释。

4. 用75 %酒精消毒冻存管表面，在生物安全柜中小心开盖，用移液枪将所有细胞吸出，以滴加的方式或者是将枪头深入液面下，将细胞加入到预热的培养基中。此时细胞比较脆弱，细胞膜表面还未完全恢复，剧烈的吹打会造成细胞活率下降。因此，需要以轻柔的方式稀释细胞冻存悬液。轻柔颠倒混匀，充分稀释冻存液，有条件可以静置1分钟，使细胞恢复渗透压，再进行下一步的离心操作。

5. 250 g离心4 min，离心后去除上清，加入2毫升预热的完全培养基，轻柔重悬细胞沉淀。有条件可以进行台盼蓝活细胞计数。

注意事项：离心的目的有两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转速不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转速过高活细胞受压过大，会导致死亡。我们推荐250 g离心4 分钟。离心后，将冻存液倒干净，且一定要倒干净。悬浮细胞和贴壁比较慢的细胞一定要离心；当然，也有不适合进行离心的细胞，可以将解冻后的细胞悬液稀释后直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。比如原代细胞在复苏融化后，尽量不要进行离心操作，直接补足培养基，使细胞分散均匀，待细胞贴壁后，进行换液处理。此方式也适用于其他冻存状态一般的细胞。

6. 将细胞平均接种在一个T25瓶或者是底面积相当的培养容器中，加入足量的完全培养基，摇匀细胞，将培养容器放入37 ℃培养箱中培养。

注意事项：需要注意接种的培养器皿的底面积大小，培养器皿底面积较大，细胞密度低，细胞间交流减少，细胞也就生长缓慢。一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。

7. 复苏次日，观察细胞状态并换液

换液也是为了更进一步去除DMSO，还需要注意贴壁/半贴壁细胞复苏24小时后不应扰动，部分贴壁较慢的细胞，复苏48小时不应扰动。

常见问题及解答

Q1: 为什么细胞复苏后，细胞很少？

A1: 细胞冻存前活细胞少，状态不佳；细胞解冻速度过慢；细胞冻存悬液在常温下时间太久；未充分稀释冻存液；离心速度不恰当。

Q2: 为什么细胞复苏后，很多难以贴壁?

A2: 排除培养基问题，主要考虑细胞冻存复苏过程中缓冻快融操作异常或是细胞冻存前密度或者活率未达到冻存条件。另外冻存细胞的时候消化时间过长，太长的消化时间会上细胞复苏时失去贴壁能力。

Q3: 为什么细胞贴壁了，却长不起来?

A3:（1）细胞密度问题，细胞倾向维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养器皿中培养。

（2）有些细胞需要复苏一周后才会发生明显的变化。

（3）还有一些是细胞特性，细胞在密度低的时候，生长缓慢。

（4）另外的原因是细胞在冻存前状态就不佳，例如消化时间过长，细胞表现为先贴后死，复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。