ChIP-seq等揭示WWOX基因通过上调Myc促进骨肉瘤发生发展的表观调控机制｜Cell Death Dis

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是一种高侵袭性骨肿瘤，主要影响儿童和青少年。这种恶性肿瘤与不良临床结果相关，尤其是肺转移。由于其罕见性和生物学异质性，对其分子基础研究有限，阻碍了有效疗法的发展。WW结构域氧化还原酶（WW domain-containing oxidoreductase，WWOX）是一种在人骨肉瘤中经常发生变化的基因，使用Osterix1-Cre转基因小鼠双敲除Wwox和Trp53（DKO）已被证明可加速骨肉瘤发展。

2024年1月5日，以色列耶路撒冷希伯来大学医学院Rami I. Aqeilan团队在《cell death & disease》杂志发表题为“WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc”的研究论文。本研究通过构建一个可追踪的骨肉瘤小鼠模型，研究了WWOX基因在骨肉瘤发展中的作用，尤其是Myc基因及其靶基因MCM7的调控机制。研究结果表明，BM MSC可能是骨肉瘤的起源细胞，且Myc和其靶基因可能是骨肉瘤发生的早期分子事件，这为骨肉瘤的早期诊断和治疗提供了新的视角。

标题：WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc（WWOX基因通过上调Myc促进骨肉瘤发展）

时间：2024-1-5

期刊：cell death & disease

影响因子：IF 9

技术平台：ChIP-seq、RNA-seq等

研究摘要

本研究构建了一个可追踪的骨肉瘤小鼠模型，该模型通过单敲除Trp53（SKO）或双敲除Wwox/Trp53（DKO）并表达tdTomato报告基因。通过追踪不同时间点的Tomato表达，研究者在非骨肉瘤携带小鼠骨髓（bone marrow）间充质干细胞（Mesenchymal stem cells ,MSC) （young BM，年轻BM）中检测到早期的tdTomato阳性细胞。分析结果表明双敲除年轻BM细胞（DKO yBM）在体外和体内均表现出致瘤特性，这些双敲除年轻BM细胞的分子和细胞表征揭示了其与骨肉瘤肿瘤细胞的相似性。与单基因敲除年轻BM细胞相比，双基因敲除年轻BM细胞中观察到Myc及其靶基因上调的转录组变化。Myc的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析揭示了Myc在双敲除年轻BM细胞中对Myc靶基因的富集增加，而Myc靶基因在双敲除的年轻BM细胞中上调。双敲除年轻BM细胞中WWOX的恢复降低了Myc蛋白水平。相对于单敲除年轻BM细胞，MCM7（Myc的一个已知靶基因）在双敲除年轻BM中上调。使用辛伐他汀（simvastatin）抑制MCM7表达导致双敲除young BM细胞的增殖和肿瘤细胞生长减少。研究结果揭示了BM间充质干细胞（BM MSCs）是研究骨肉瘤和Myc及其靶标作为WWOX效应器和骨肉瘤发生过程中早期分子事件。

 研究结果

（1）构建可追踪的骨肉瘤小鼠模型

图1：可追踪的骨肉瘤细胞小鼠模型

A.实验骨肉瘤（OS）小鼠模型的示意图。

B.Cre阴性（Cre-），Cre阳性（Cre+ WT）和双敲除（DKo tom）小鼠的基因组PCR。左panel的标签表示引物对，右panel的标签表示预期的条带大小。

C.从（1）Cre阴性小鼠，（2）Cre+ WT小鼠，（3）DKO TOM小鼠提取的骨骼荧光显微镜图像。

D.来自Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠的冷冻骨切片的免疫荧光图像。红色信号代表内源性tdTomato，蓝色信号代表核染色hoechst。

E.2月龄（2m）的Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠BM细胞的流式细胞术分析。10.2±2.3表示与同龄Cre-小鼠相比，Cre+ WT和DKO
BM中tdTomato阳性细胞百分比。

F.在Cre+
WT和DKO BM细胞中，免疫印迹分析对p53、WWOX、p21和tdTomato蛋白在未电离辐射暴露（0分钟）及电离辐射暴露（IR-10Gy）（30分钟和120 分钟）的表达。（相对于Cre+ WT的定量印迹分析）。

WT：野生型，DKO：双敲除，BF：bright
field，RFP：红色荧光蛋白（red
fluorescent protein），BM：骨髓（bone
marrow）。

（2）OS小鼠的骨髓（BM）细胞具有致瘤性

图2：OS小鼠的BM细胞具有致瘤性并表现出转移性。

A.从Cre−小鼠收集的BM（Cre-Direct BM）、从DKO
TOM小鼠收集的肿瘤（Direct-tumor）和成对BM细胞（Direct-BMT）进行流式细胞术分析，显示tdTomato表达百分比（上panel，代表性实验。下panel，14只小鼠的tdTomato阳性细胞百分比的平均值）。

B.与Cre+WT
BM细胞相比，成对BMT和肿瘤细胞的集落形成试验（代表性图像左图）（Giemsa染色和荧光显微镜图像），Cre+BM、BMT和肿瘤细胞的集落数量的定量右图（n=3）。

C.与对照上图相比，NOD/SCID小鼠胫内（IT）注射BMT和肿瘤细胞后发生的OS肿瘤的代表性图像，H＆E验证OS中panel的组织学特征。组织学验证显示为成骨细胞型OS，下panel为肿瘤发展的免疫荧光图像。红色信号代表内源性tdTomato，蓝色信号代表核染色hoechst。

D.条形图表示IT注射对照BM细胞（对照）、BMT和肿瘤细胞后出现OS的免疫低下小鼠的百分比。

E.伤口愈合实验迁移。肿瘤和BMT细胞相对创伤密度时间图（n=3）。

F.创面愈合实验。肿瘤和BMT细胞相对创伤密度的时间图（n=3）。

图3：BMT与肿瘤细胞的分子相似性

A.肿瘤细胞（n=3）、成对BM细胞（BMT）（n=3） 和对照BM细胞（n=4）的主成分分析（PCA）图 。

B.肿瘤细胞（n=3）、成对BM细胞（BMT）（n=3）与对照组比较的Venn图。BMT与肿瘤细胞之间的共有基因为164。

C.热图显示对照细胞和BMT/肿瘤细胞中差异表达基因。

D.通路富集分析。

E.对照组和BMT/肿瘤细胞差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）。

（3）young BM（yBM）细胞表现出致瘤性

图4：年轻BM（yBM）衍生细胞表现出致瘤和转移能力

A.不同年龄的基因编辑BM细胞（DKO-BM）和野生型BM细胞（Cre+ WT BM）中tdTomato阳性细胞百分比的流式细胞术分析结果（n = 3）。

B.年轻非肿瘤携带小鼠（yBM-DKO）的BM细胞、Cre阴性小鼠（Cre-BM）和Cre阳性野生型小鼠（Cre+
WT BM）的BM细胞进行集落形成实验。左panel展示Giemsa染色集落，右panel展示荧光显微镜下的集落图像。77.6 ± 11.6表示yBM-DKO中的集落数量。

C.胫内注射（IT）yBM细胞3-4个月后，免疫功能低下小鼠发展出OS肿瘤。上panel展示H&E染色的肿瘤组织学验证，显示了纤维母细胞/成骨细胞型OS。下panel展示发展的肿瘤免疫荧光图像。红色信号代表内源性tdTomato，蓝色信号代表核染色的Hoechst。

D.条形图展示了在胫内注射（IT）yBM、肿瘤和对照（Cre-BM）后，免疫功能低下小鼠发展成OS的百分比。

E.在NOD/SCID小鼠中，通过静脉注射（IV）yBM细胞后，肺转移的光镜图像、tdTomato免疫荧光图像和H&E染色图像。分别代表了肺转移的可视化。

F.条形图展示在静脉注射yBM细胞后，NOD/SCOD小鼠发展成肺转移的百分比（收集1.5月龄和6月龄小鼠）。

（4）导致骨肉瘤发生的早期分子变化

图5：导致骨肉瘤发生的早期基因（yBM vs肿瘤细胞和yBM vs BMT细胞）。

A.肿瘤细胞（n=3）、yBM细胞（1.5月龄和4月龄）（n=6）和对照BM细胞（n=4)的主成分分析（PCA）。 

B.肿瘤细胞（n=3）、yBM细胞（1.5月龄和4月龄）（n=6）和对照BM细胞（n=4)的维恩图分析。yBM和肿瘤细胞之间的共有基因有303个。

C.yBM和肿瘤细胞之间差异表达基因的通路富集分析。

D.肿瘤细胞（n=3）、yBM细胞（1.5月龄和4月龄）（n=6）和对照BM细胞（n=4)的PCA图。

E.肿瘤细胞（n=3）、yBM细胞（1.5月龄和4月龄）（n=6）和对照BM细胞（n=4)的Venn图。yBM和BMT细胞之间的共有基因有471个。

F.yBM和BMT细胞之间差异表达基因的通路富集分析。

G.对照和yBM/肿瘤细胞之间差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）。

H.对照和yBM/BMT细胞之间差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）。

（5）WWOX丢失导致yBM细胞中的Myc改变

图6：WWOX表达与OS中的c-Myc呈负相关。

A.左panel显示单敲除（SKO）和双敲除（DKO）yBM细胞的Venn图分析（n=3） ，其中308个基因是yBM DKO的特有基因。右panel的条形图表示与SKO yBM相比，DKO特有的显著通路（Myc靶标）。

B.对照BM（NRM）、SKO和DKO的yBM细胞差异表达基因的热图（n=3)。

C.条形图表示从对照BM、SKO和DKO-yBM细胞中的一些Myc靶基因的RNA-seq测序数据中的reads数。

D.DKO和SKO-yBM细胞中Myc靶基因的mRNA水平。

E.启动子区域最高Myc富集的前50个基因的归一化表达（TPM）的彩色编码热图。

F.启动子区域Myc缺失的50个基因的归一化表达（TPM）的彩色编码热图。

G.SKO-yBM和DKO-yBM细胞的WWOX、c-Myc和p53的免疫印迹。P：亲本细胞系，OE：过表达，PC：阳性对照，用nutlin（MDM2抑制剂）处理的HepG2细胞。展示了相对于SKO的WWOX和c-Myc蛋白水平的定量分析。

H.箱形图表示来自TCGA TARGET GTEx的人骨肉瘤样品中WWOX和Myc表达之间的相关性。高WWOX样本>第75百分位，低WWOX<第25百分位，y轴代表Myc表达。PV：p值。

（6）DKO-yBM细胞中MCM7上调有助于其致瘤性

图7：MCM7上调促进肿瘤进展

A.从1.5月龄、2.5月龄和4月龄的非肿瘤携带小鼠收集中的Cre+WT BM（对照）、DKO-yBM中MCM7的mRNA水平（n = 3). ****p值 < 0.0001.

B.Cre+WT BM（对照）、DKO-yBM、BMT和肿瘤细胞中MCM7和c-Myc的免疫印迹（数字表示生物重复）。上图显示相对于Cre+WT BM细胞（对照）的MCM7蛋白水平的定量。下图显示SVA（µM）处理24小时后Cre+WT BM（对照）、DKO-yBM、BMT和肿瘤细胞（数字表示生物重复）中MCM7和c-Myc蛋白水平的定量。

C.SVA（µM）处理24小时后Cre+WT BM（对照）、DKO-yBM、BMT和肿瘤细胞的MTT增殖实验，图表显示各组细胞活力相对于未处理细胞的倍数变化。

D.SVA（µM）处理24小时后Cre+WT BM（对照）、DKO-yBM、BMT和肿瘤细胞（数字表示生物重复）的克隆形成实验 图表显示了各组细胞存活率相对于未处理细胞的倍数变化。

E.SVA（µM）处理24小时后SKO和DKO-yBM细胞（每组两个生物重复序列）的MTT增殖实验，图表显示各组细胞活力相对于未处理细胞的倍数变化。

F.在NOD/SCID小鼠中，通过胫内注射（IT）yBM细胞后，比较了对照组（未处理）和SVA（60 mg/kg）处理组肿瘤的平均大小（cm3）和重量（g）。（*p<0.05，**p<0.01)。

G.对照组（vehicle）和SVA处理组肿瘤的H&E染色显示OS成骨细胞/成纤维细胞特征，对照组和SVA处理的肿瘤的MCM7的IHC染色（左图），与对照组相比（右图），MCM7阳性染色的细胞核的定量（**p<0.001)。

研究结论

本研究强调了WWOX和p53作为肿瘤抑制基因在骨肉瘤（OS）发展中的重要性，Osx1阳性祖细胞中WWOX和p53的联合缺失（双敲除）导致了细胞的转化和生长优势。这种优势至少部分由Myc过表达介导，可能发生在OS细胞增殖和存活的早期阶段。仅p53敲除不足以驱动观察到早期分子变化，WWOX沉默和Myc过表达可能是预防和治疗OS患者的的潜在靶点，为研究OS转化、进展和干预的分子机制提供了细胞和遗传平台。

 参考文献：

AkkawiR, Hidmi O, Yehya AH, Monin J, Diment J, Drier Y, Stein GS, Aqeilan RI. WWOXpromotes osteosarcoma development via upregulation of Myc. Cell Death Dis. 2024Jan 5;15(1):13. pii: 10.1038/s41419-023-06378-8. doi:10.1038/s41419-023-06378-8. PubMed PMID: 38182577.