7.5分SCI，极简的关键基因筛选，接上靶向药物预测及验证，这个思路发文章真的不难，可重复！

影响因子：7.5

研究概述：肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占多数。NSCLC主要亚型为肺腺癌(LUAD)。尽管LUAD的诊断和治疗取得了很的大进步，但早期诊断的生物标志物仍不能满足临床需求。因此，作者利用GEO&TCGA数据库进行了生物信息学分析，找到了10个差异表达基因并与LUAD生存预后相关。随后，基于10个关键基因作者利用L1000FWD数据库，鉴定出了一种有前景的小分子药物Aminopurvalanol A，并通过分子对接和体内外实验对其进行了验证。结果表明，TOP2A、CDH3、ASPM、CENPF、SLC2A1和PRC1是早期LUAD潜在的检测生物标志物；并证实了Aminopurvalanol的有效性和安全性，为LUAD的临床管理提供了有价值的见解。

该思路筛选关键基因太过简单，可以结合百种机器学习建模并筛选基因，回使文章更饱满。

研究步骤如下：

研究结果：

鉴定LUAD差异表达基因

作者首先收集了为了找到LUAD差异表达基因，对GSE10072、GSE32863、GSE63459和GSE75037四个GEO数据集的原始数据进行了研究，只选择了I期和II期的样本（分别包含24、45、32和70个样本；包括匹配的正常肺组织和LUAD）。并且一共找到了316 个差异基因 (104上调& 212下调)。

接着，我们将GSE13213和GSE31210两个数据集合并，成为一个GEO_Com队列（n=318)，并与TCGA_LUAD数据集(n=388)一起进行倾向性匹配分析，以消除年龄、性别和分期的影响。作者进一步利用GEO_Com数据集对前30个上调和下调基因进行KM生存分析，结果发现共有18个基因存在统计学差异(p<0.05)，其中12个上调基因为COL1A1、MMP9、SPP1、TOP2A、ASPM、CDH3、CDC20、CENPF、SLC2A1、PRC1、PITX1和UBE2C。

随后，作者利用TCGA_LUAD数据集作为验证，生成相同18个差异基因的生存曲线。其中，10个差异基因有统计学意义(p<0.05)。6个为上调基因: TOP2A、CDH3、ASPM、CENPF、SLC2A1和PRC1(图A-F)， 4个为下调基因: AGER、CA4、CYP4B1和MFAP4(图G-J)。TCGA_LUAD和GEO_Com数据集共有10个交集基因（图k）。

作者进一步在TCGA数据集中验证了10个交集差异基因的mRNA表达水平。TOP2A、CDH3、ASPM、CENPF、SLC2A1和PRC1上调，而AGER、CA4、CYP4B1和MFAP4下调 (图A)。随后，作者对这10个关键基因进行ROC曲线分析(图B)，结果提示这些基因的表达水平在区分正常肺组织和LUAD组织方面表现出显著的准确性，可以被认为是LUAD诊断的潜在肿瘤生物标志物。

The Human Protein Atlas网站中下载的免疫组化结果同样表明：与正常肺组织相比，LUAD组织中TOP2A、CDH3、CENPF、SLC2A1、PRC1表达上调，相反，AGER、CA4、CYP4B1、MFAP4表达下调。

L1000FWD数据库筛选候选药物分子

既然找到了10个差异表达的基因，何不寻找对应药物？作者使用L1000 FWD在线数据库对6个上调基因和4个下调基因进行搜索（相似度评分、p值和综合评分等因素），选择出了具有负相关性的候选药物分子：Aminopurvalanol A (PubChem CID: 6604931；分子量：403.9 g/mol，分子式：C19H26CLN70，二维结构)。

接着作者进行了分子对接，将前面找到的10个差异基因作为受体，三维结构为: TOP2A (PDB: 6zy7)、CDH3 (AlphaFoldDB: AF-P22223-F1)、ASPM(同源性建模，模板蛋白PDB: 2dfs)、CENPF(同源性建模，模板蛋白PDB: 6so3，序列一致性:22%)、SLC2A1 (PDB: 5eqg)、PRC1 (AlphaFoldDB: AF-O43663-F1)、AGER (AlphaFoldDB: AF-Q15109-F1)、CA4 (PDB: 3F7B)、CYP4B1 (PDB: 5t6q)和MFAP4 (AlphaFoldDB: AF-P55083-F1)。利用Sybyl-X 2.0软件对目标蛋白与Aminopurvalanol A进行高精度分子对接（评分结果包括总分、Cscore、Crash和Polar）。在这里，作者主要关注总分和Cscore作为结合亲和力的测量（考虑到空间互补性和能量匹配，Cscore值越高表明配体与受体蛋白的结合相互作用越强）。结果发现，Aminopurvalanol A和靶蛋白之间主要是通过氢键进行组装的。例如，Aminopurvalanol A与TOP2A形成了三个氢键（一个与ARG-804的距离为1.9 Å，两个与残基SER-802的距离为1.9 Å和2.5 Å）；与CDH3形成了四个氢键（残基GLU-317, ILE- 318, ASP-320和PRO-357，距离分别为1.9 Å， 2.9 Å， 2.4 Å和2.2 Å）；与ASPM形成3个氢键（残基ARG-2111、GLU-1464和VAL-718的距离分别为1.9 Å、2.0 Å和2.2 Å）。

体内外基础实验验证

作者最后用实验去证实Aminopurvalanol A的抑制作用。使用CCK-8法评估细胞暴露于不同Aminopurvalanol A浓度下(0、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5和25 μM)，在48小时后的细胞活力。结果表明，Aminopurvalanol A对人LUAD细胞系PC9、H460、H1299、小鼠肺癌细胞系LLC和人正常肺上皮细胞系Beas-2B的活性均有剂量依赖的抑制作用（图B）。PC9、H460和H1299细胞系的IC50分别为2.17μM、3.92μM和5.29 μM。LLC细胞系的IC50为3.17μM。这表明在相对较低的Aminopurvalanol A浓度下就可以抑制LUAD细胞系的增殖。Beas-2B细胞株的IC50值为6.47 μM，显著高于PC9、H460、H1299和LLC细胞株的IC50值，说明Aminopurvalanol A对正常肺组织具有一定的安全性（图B）。克隆形成实验表明Aminopurvalanol A对PC9、H460和H1299细胞的集落形成能力有明显的抑制作用（图C）。将PC9、H460和H1299细胞暴露于Aminopurvalanol A的IC50浓度48小时后，流式检测发现处于G2/ M期的细胞比例显著增加，这揭示了Aminopurvalanol A是通过在G2/M期引起细胞周期阻滞来抑制肿瘤细胞增殖（图D）。最后作者进行了体内实验：用LLC细胞构建皮下瘤，当肿瘤体积达到30-60 mm3后，连续10天腹腔注射Aminopurvalanol A。结果显示，Aminopurvalanol A对肿瘤生长有明显抑制作用；生存期延长(图F-K)。

此外，H&E染色显示，Aminopurvalanol A对小鼠的重要器官没有明显的病理改变，证实了其在体内应用的安全性。

研究总结：

本篇文章作者分析了5个LUAD数据集（TCGA+GEO），确定了TOP2A、CDH3、ASPM、CENPF、SLC2A1和PRC1六个上调差异基因可作为早期LUAD患者的潜在诊断标志物。此外，内部和外部数据库验证确定了10个关键基因的预测意义。其中，Aminopurvalanol A有希望成为治疗LUAD的候选药物。随后的体外和体内实验验证了Aminopurvalanol A的有效性和安全性。总的来说这篇文章思路很清晰，没有用到很多复杂的算法和体内外实验，值得大家学习：找到差异基因进行多数据集验证，通过L1000FWD数据库筛选候选药物分子，分子对接+体外CCK8/克隆形成验证，最后小鼠体内观察用药后皮下瘤大小。